Manual de control microbiológico del agua y del líquido de diálisis (página 2)

Las Unidades de Hemodiálisis
están sujetas a unas normas de
funcionamiento en cuanto la calidad del
agua y del
líquido de diálisis (LD). Estas normas
varían de unos países a otros y están
evolucionando en el sentido de exigir más calidad. Las
mejoras técnicas
del tratamiento del agua y LD han logrado que su calidad en
cuanto a contaminación por partículas y
solutos sea buena. Sin embargo, no ha sucedido así con
la
contaminación bacteriana y las endotoxinas, que han
persistido como un problema importante.

El líquido de diálisis
constituye una parte fundamental de la biocompatibilidad y de
ahí, la necesidad e importancia de tratar adecuadamente
el agua
utilizada en su fabricación y de alcanzar un adecuado
nivel de calidad. Por otro lado, no debemos olvidar que el
personal de
las salas de diálisis es responsable de la calidad del
líquido de diálisis, a diferencia de los
dializadores y monitores que
están garantizados por casas comerciales que se
responsabilizan de su calidad y de cumplir las normas vigentes al
respecto. El líquido de diálisis, por el contrario,
se fabrica en el momento y en la propia unidad de
diálisis, sin posibilidad de controles de calidad previos
a su utilización e indudablemente, bajo la responsabilidad del personal técnico y
sanitario tratante.

El agua suministrada a las ciudades debe cumplir una
serie de requisitos imprescindibles que la hacen apta para el
consumo
humano, pero aún así, no sirve para la
fabricación del líquido de diálisis, es
necesario purificarla y mantener unos grados de pureza muy
superiores a los del agua potable.
Esto es así porque, cada semana, la sangre del
paciente sometido a hemodiálisis se pone en contacto con
270-600 litros de agua y lo hace a través de una membrana
nada selectiva y por otro lado, la insuficiencia
renal le impide eliminar los contaminantes acumulados,
pudiéndole ocasionar una verdadera
intoxicación.

Recogida de la
muestra del líquido de Diálisis

La siguiente metodología corresponde a las
recomendaciones de la Sociedad
Española de Enfermedades
Nefrológicas. (Ref. Rev Soc Esp Enferm Nefrol 2004; 7
(1): 6/8)

Los controles microbiológicos del
agua purificada o altamente purificada se realizaran al menos una
vez al mes.

Las muestras se deberán recoger aproximadamente
en la mitad del lapso de tiempo que
media entre dos desinfecciones programadas con el fin de
adelantar la desinfección en el caso de que los resultados
estén por encima de un nivel tolerable. En todo caso, se
deberán realizar después de 4 días de la
última desinfección.

Puntos de toma de muestras: En el periodo de
validación se tomarán muestras del agua de aporte;
del agua descalcificada; del agua tratada a la salida de la
osmosis y al
menos en el 20 % de los monitores de la toma de agua;
también del LD a la entrada al dializador y del drenaje.
En el periodo de mantenimiento
no es necesario tomar muestras en el pretratamiento, a menos que
se detecte contaminación significativa del agua tratada.
Las tomas de los puertos de toma de agua de los monitores se
deberán realizar al comienzo de la sesión de
diálisis. Si se emplean fiadores para abrir la
válvula de seguridad y
permitir la salida de agua por los puertos de conexión de
las máquinas
de diálisis, estos elementos deberán haber sido
esterilizados previamente (autoclave o gas).

La carga bacteriana de cada punto de muestreo de agua
de diálisis debe recogerse después de dejar correr
el chorro durante un periodo de tiempo estrictamente controlado,
1 minuto o, preferiblemente, hasta que drene una cantidad fija de
agua de un litro, ya que los primeros decilitros de agua suelen
tener una carga bacteriana sensiblemente superior.

El líquido de diálisis deberá
recogerse de la salida correspondiente del monitor
empleando una jeringuilla o un contenedor
estéril.

Las muestras se pueden recoger en cualquier recipiente
de vidrio o plástico
estéril. Un envase estéril de urocultivo de 50 ml
de capacidad es adecuado para el agua purificada o el
líquido de diálisis estándar, si se va a
evaluar carga microbiana. En caso de determinación de
endotoxinas, se recomienda una jeringuilla estéril o un
frasco de vidrio previamente despirogenizado. Es aconsejable
etiquetar los recipientes previamente, indicando el lugar de
recogida. Para determinar la carga bacteriana del agua o
líquido de diálisis ultra pura, es necesario que se
recoja un volumen de agua
superior a un litro.

Los frascos conteniendo la muestra deben
conservarse en hielo o refrigerarse a 4º C, entre 3 y 6
º C, hasta el momento de su procesamiento para cultivo.
Dicho cultivo deberá realizarse en el menor tiempo
posible, máximo 24 horas.

Dada la pureza del agua recibida
habitualmente, se recomienda sembrar un volumen de 5 ml de
muestra con 10 ml de medio de cultivo líquido,
monitoreando los cultivos a diario. Si eventualmente hubiera una
contaminación considerable, usualmente las colonias
aparecen al segundo día, por lo que se recomienda sembrar
nuevamente 1 ml de muestra que se ha guardado convenientemente
refrigerada, con el fin de obtener un contaje apropiado e
informar al centro de tratamiento.

El volumen inoculado deberá
ajustarse a los límites y
a la cantidad de gérmenes que se presume encontrar. Por lo
general se utilizan 1 a 5 ml. En el caso que el agua estuviera
contaminada, se deberá diluir la muestra con agua
estéril para lograr un recuento válido.

3.1 Material necesario:

• Recipientes estériles de 100
ml. con tapa.

• Parafilm.

• Cubeta con hipoclorito sódico
al 2%.

• Cubeta con agua tratada.

• Cubeta vacía para drenaje del
dializado.

• Guantes de látex.

• Condiciones para la recogida del
  agua :

• 1. Recogida escrupulosa de la
  muestra: escoger un punto de acceso directo al circuito;
  desinfectar el punto en donde se tomará la muestra y
  dejar correr el líquido, desechando los primeros
  mililitros. El volumen de al menos 1 ml se recogerá en
  un recipiente estéril y libre de
  endotoxinas.

• 2. La muestra debe obtenerse
  mientras el aparato está todavía enjuagado en
  agua, inmediatamente después de enjuagar todo el
  desinfectante residual.

• 3. Sin tocar la abertura del
  conector del dializador o la zona circundante, sujetar el
  conector sobre una cubeta vacía de modo que el
  líquido fluya directamente de la parte inferior del
  conector. Deje drenar por 2 minutos.

• 4. Colocar el recipiente de
  recogida de muestra estéril bajo el chorro y recoger
  asépticamente una muestra de 100 ml del
  líquido. Cerrar el recipiente con parafilm y
  rotular.

• 5. La muestra se mantendrá
  a 4 º C y transportadas en frío al laboratorio,
  el cual la deberá sembrar antes de las 24
  h.

El punto de muestreo no debe limpiarse con
desinfectantes del tipo hipoclorito o ácido acético
etc. Es admisible el empleo de
alcohol al 70
% permitiendo después su completa evaporación. Es
recomendable el uso de guantes estériles y que la recogida
se realice entre dos personas, tratando de minimizar la
contaminación cruzada.

Observaciones:

• a) El monitor no debe estar
  conectado al paciente.

• b) El personal que vaya a recoger
  las muestras utilizará guantes de
  látex.

• c) Desconectar del monitor la
  línea de dializado (tapón azul) y sumergirla en
  la

cubeta con Hipoclorito sódico al 2%
durante 30 minutos.

• d) Enjuagar la línea 3
  veces sucesivas en la cubeta con agua tratada cambiando el
  agua cada vez.

• e) Volver a conectar la
  línea al monitor.

Control
microbiológico del agua

Se deben realizar controles
bacteriológicos del agua al menos una vez al mes. Un tema
fundamental es cómo y cuándo tomar las muestras
bacteriológicas y como procesarlas, y la
realización de la prueba de endotoxinas. Se debe buscar la
máxima sensibilidad y para ello, es preciso utilizar
volúmenes grandes, con una recogida escrupulosa y un buen
transporte,
sembrándolos precozmente, en medios de
cultivo pobres, a temperatura
ambiente y por
periodos largos.

Los controles bacteriológicos del agua se
realizarán fundamentalmente en las tomas de agua de
algunos de los monitores, escogidas de forma rotatoria. En caso
de contaminación, se deberán tomar en distintos
puntos del sistema de
tratamiento: en primer lugar del agua de la red, una vez pasado el
descalcificador, el filtro de carbón activado y la
ósmosis inversa.

Los puntos en los que es más frecuente encontrar
contaminación son en el filtro de carbón activado y
después del filtro, y en el sistema de distribución, si existen puntos de
estancamiento. También se deberán tomar muestras
del LD, predializador, en cada una de las máquinas de
hemodiálisis.

Un problema de gran importancia es la formación
de biofilm bacteriano en los circuitos.
Estos se relacionan generalmente con contajes de más de
1000 UFC/ml en el líquido de diálisis. En su
destrucción es fundamental usar tanto desincrustantes
(ácido cítrico, ácido peracético),
como detergentes (hipoclorito (lejía) y desinfectantes con
capacidad oxidante (lejia y peróxido de hidrógeno), en concentración y
tiempo suficientes.

• Medios de cultivo recomendados
  :

La Farmacopea Europea aconseja el medio de
cultivo a base de hidrolizado de caseina de soja. La AAMI
consigna el medio de cultivo "TSA" (Tripticasa de Soya y
Agar). Pueden utilizarse también otros medios conocidos
por su capacidad de permitir el crecimiento de un amplio espectro
de microorganismos. Debido a que los Microorganismos que habitan
en el circuito de agua no poseen nutrientes, el medio empleado
para el crecimiento debe ser similar, bajo en nutrientes. Otro
medio de cultivo pobre en nutrientes recomendado es el
Reasoner´s 2-agar (R2A) y el Tryptone glucose extract agar
(TGE-agar)

Luego de haber comparado la sensibilidad de
diversos medios y la temperatura de incubación a 37
ó a 20 °C, Ledebo y Nystrand ( Defining the
microbiological quality of diálisis fluid. Artif Organs
1999; 23: 37-43 ) han recomendado el medio "TGE-Agar"
(Tryptone Glucose Extract Agar) el que se incuba por 2
días a 20 °C. Al respecto, en otra publicación
los autores expresan lo más significativo de la presente
recopilación: "Este estudio demuestra un incremento de 10
a 100 veces en el recuento bacteriano del fluido de
diálisis incubado en Tryptone Glucose Extract Agar (TGEA)
a 20 °C durante 5 días comparados con la
incubación en Agar de Trypticasa y Soya a 37 °C
durante 2 días.-"

4.2 Procedimiento:

• a) 1.0 ml de la muestra debe
  sembrarse en un medio líquido de enriquecimiento como
  el Tioglicolato con indicador, e igual cantidad en platos
  Petri conteniendo un medio pobre en nutrientes, como el
  Reasoner´s 2-agar ( R2A) o el Tryptone glucosa extract
  agar ( TGE-agar ) o también puede usarse el Tripticase
  Soy Agar ( TSA ).

• b) Incubar a temperatura ambiente
  entre 21 – 24 °C.

• c) Leer a las 48 horas y una
  última lectura tardía a los 5 – 7
  días.

• d) Cuantificar el número de
  colonias por mililitro de muestra y determinar el
  germen.

Nota: La AAMI ( American
Association for Medical Instrumentation ) recomienda el
medio de TSA a 37°C y lectura a las
48 horas.

Interpretación: Máximo
número de colonias admitido por la AAMI: 200 UFC/ml para
el agua y 2.000 UFC/ml para la solución de
diálisis.

4.3 Método del
Hospital Mount Sinaí:

Para el cultivo del agua (Líquido
Pre-Diálisis):

a) Cultivo:

•   b) Interpretación
  del Cultivo :

Examine el agar sangre, el McConkey y el
caldo anaeróbico diariamente durante 4 días de
incubación. Si no hay crecimiento en los platos, pero
evidencia de crecimiento en el Tioglicolato, realice
tinción de Gram y subcultivo en medios para crecimiento de
aerobios, anaeróbicos y con requerimiento de CO2. Todos
los aislamientos deben ser identificados.

c) Reporte:

a) Tinción de Gram: Reporte la
presencia o ausencia de organismos.

b) Cultivo:

Reporte negativo: "No hubo
crecimiento"

Reporte Positivo: Reporte todos los
aislamientos con su correspondiente sensibilidad. No cuantifique.
Adicione el siguiente comentario si el aislamiento es solo del
medio de Tioglicolato: "Crecimiento del caldo de cultivo
solamente, indicativo de pequeño número de
microorganismos y/o contaminación."

Es importante señalar otras dos
metodologías reconocidas y aprobadas para el cultivo del
agua y del dializado. Estas son las recomendaciones del CDC y las
del AAMI (American Association for Medical
Instrumentation).

4.4 Método del
CDC:

a) Cultivar 0,5 ml de muestra en Tripticase
Soya agar (TSA) BBL.

b) Incubado a 37ºC durante 48
horas.

4.5 Método del AAMI (American
Association for Medical Instrumentation ) :

a) Cultivar de 1.0 ml de la muestra en Low
Nutrient Agar R2A (Difco).

b) Incubar durante 1 semana a temperatura
ambiente.

Formulario de
solicitud de examen

CAJA DE SEGURO
SOCIAL

LABORATORIO CLÍNICO
CHMDrAAM

FORMULARIO DE SOLICITUD DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

EN MUESTRAS DE AGUA DE
DIÁLISIS

Fecha de recolección:
.……………………Hora
de
Recolección….…………

Cantidad de Cantidad de Muestra:
………………

Nombre de quién entrega la
muestra…………………………………………………

Lugar donde se obtuvo el Lugar donde se
obtuvo la muestra:
……………………………………………………..……………………………………

Tipo de muestra:

Agua potable (Red): Agua
tratada:

Fuente de obtención de la
muestra: Agua Red

Agua Post-Tratamiento:

Post-Filtro Arena Post-Ablandadores Post-
Osmosis Reversa

Post-Desionización Agua
diálisis Pre-Filtro

Agua diálisis Post-Filtro

Temperatura de transporte de la
muestra: ……?C.

ANÁLISIS
SOLICITADOS:

Enumeración de bacterias
totales (Heterótrofas)

Recuento de coliformes

Recuento de Mohos y levaduras

Detección de un microorganismo
específico. Indique:
……………………………

Determinación de
Endotoxinas

Especificar razones para qué se
requiere este análisis:

Vigilancia:
Investigación: Otro:

Nombre de la persona que
recibe la Muestra :
………………………………….…..

Fecha de
recepción:………………..
Hora:
……………..

Nº interno de la muestra:
………………………………..

Firma responsable:
___________________________

Determinación
de niveles de endotoxinas

6.1 Principio:

Las endotoxinas, lipopolisacaridos de la
pared celular de bacterias gram- negativas, desencadenan una
reacción de coagulación sobre el LAL.

Este test de
coagulación, basado en la incubación, a 37º C
por 1 hora, de series de dilución de muestras y del
estándar, en presencia del reactivo LAL, permite, mediante
la determinación del punto final de coagulación
(gel firme al giro de 180 º) la obtención de
resultados reproducibles. Es importante anotar que no existe una
relación de equivalencia entre la presencia de colonias de
Gramnegativos y los niveles de endotoxinas. Es posible que se
detecten niveles de endotoxinas elevados, sin la presencia de las
colonias de microorganismos.

Fuente: Limulus Amebocyte Lysate
(Pyrotell), Método para la Detección y
Cuantificación de Endotoxinas. Associates of Cape Cod,
Inc.

6.2 Empresas
productoras del reactivo :

a) Associates of Cape Cod, Inc
Falmouth Technology Park 124 Bernard E. Saint Jean Drive East
Falmouth, MA 02536-4445

Tel. 508-540-3444

Fax.
508-540-8680

www.acciusa.com/

b) Bio-Whittaker Bioproducts,
Inc

8830 Biggs Ford Rd. Walkersville, MD 21793
Tel: 800/638-8174 Fax: 301/845-8338

www.biowhittaker.com

c) Cambrex Corporation

1205 11th Street Charles City, Iowa50616
(641) 257-1000

www.cambrex.com

6.3 Método rápido de
detección:

Recomendaría la utilización
de un test rápido de screening, conocido como Single Test
Kit, como el nuevo test de Associates of Cape Cod,
especialmente para agua y líquido de dializado llamado
Pyrosate® ( Código
PSD25, kit de 25 pruebas ) que
ya viene con sensibilidad de 0.25 EU/ml , tubos despirogenizados
y resultados en 30 minutos.

Hemos recomendado una sensibilidad del
Pyrosate®, de 0.25 EU/ml , ya que es el punto de corte
aceptable para el líquido de diálisis en base a la
Farmacopea Europea.

Otro kit equivalente es el de Cambrex
Co ( Código N189-25, Kit de 25 test ), el cual es un
tubo libre de pirógenos que trae incluido el reactivo LAL
liofilizado ( Pyrogen® ) con una sensibilidad de 0.25
EU/ml.

En ambos casos la metodología
incluye:

• a) Adicionar el volumen de muestra
  indicado en el inserto

• b) Incubar por el tiempo
  señalado en el inserto

• c) Observar por formación
  de coágulo firme en el tubo

Una prueba negativa (No
coágulo) indica que los niveles de endotoxinas de la
muestra están por debajo de la sensibilidad del reactivo
(0.25 EU/ml), por lo que la muestra es de buena
calidad.

Una prueba positiva (Presencia de
coágulo firme con el tubo invertido) indica que la muestra
contiene niveles de endotoxinas superiores a 0.25 EU/ml, lo cual
indica contaminación del agua, en base a los
niveles máximos aceptados por la farmacopeia
internacional.

Kit de Test Rápido para
Endotoxinas

Pyrosate ®

En caso de requerirse la detección
de otros puntos de corte en el reporte de la prueba, a
continuación se describe el método completo que
habría que realizar.

6.4 Test completo de
Endotoxinas:

NOTA: TODOS LOS MATERIALES Y
REACTIVOS USADOS EN ESTE ANALISIS DEBERAN ESTAR LIBRES DE
PIROGENOS.

Los materiales de vidrio y metálicos
deben ser despirogenizados mediante tratamiento térmico en
horno a 220º C por 2-3 horas.

6.4.1 Procedimiento:

6.4.1.1 Reactivos, Materiales y
Equipos:

a) LAL Pyrotell® ( Associates of Cape
Cod Inc) (Limulus Amebocyte

Lysate (Pyrotell), Método para
la Detección y Cuantificación de

Endotoxinas. Associates of Cape Cod,
Inc.), viales de 1, 10 y 50 tests.

También se puede usar viales de 5 ml
para múltiples pruebas.

Sensibilidad de 0.125 EU/Ml.

b) Control
Estándar de Endotoxina (0.5 &µg/vial)

c) Agua Destilada, libre de
pirógenos.

d) Tubos de ensayo de
vidrio de 20×150 mm.

e) Tubos de ensayo de vidrio de 10×75 mm
(Fisher Cat# 14-958B)

f) Gradillas para tubos

g) Pipetas serologicas de 0.5, 1, 2, 5 y 10
ml.

h) Micropipetas Eppendorf de 10 – 100
ul.

i) Micropipetas Eppendorf de 100 – 1000
ul.

j) Puntas (tips) Eppendorf, libres de
pirógenos 10-100 ul y 100-1000 ul

k) Parafilm

l) Bloque congelado (Ice pack/ gel
pack)

m) Eppendorf repeater, 10 ul – 5 ml, Fisher
Cat. #21-380-8.

n) Combitips de 5 ml, libre de
pirógenos, Fisher Cat. # 21-381-107.

o) Fuente de calor

p) Olla ( vidrio o
metálica)

q) Mezclador Vórtex

r) Horno 180-250º C.

s) Baño de María 37 +1º
C.

t) Cabina de flujo laminar

6.4.1.2
Metodología:

a) Preparación de la
Solución Estándar de Endotoxinas (100
ng/ml)

1.- Dentro de la cabina de flujo laminar,
levantar y remover la parte central del sello de
aluminio que
recubre la tapa del vial que contiene el
estándar de endotoxinas. Efectuar la misma
operación con el vial de agua libre de
pirógenos. No eliminar el resto del sello de
aluminio, para evitar que el tapón de goma
sea accidentalmente abierto

2.- Usando una jeringa de 5 ml, libre de
pirógenos, retirar, a través del tapón del
vial sellado, 5 ml de agua libre de pirógenos; insertar
la aguja a través del tapón de goma y
dispensar el agua dentro del vial cerrado. para
garantizar que el estándar ha conservado el
vacío original, la entrada de agua debe ser
automática por succión.

3.- Mezclar en Vórtex
intermitentemente por 30 a 60 minutos para garantizar su completa
homogeneidad. Conservar el vial frío, colocándolo
frecuentemente sobre el gel pack.

4.- Cubrir la tapa con parafilm y
refrigerar.

El Estándar de Endotoxinas puede
mantenerse hasta cuatro semanas bajo condiciones de
refrigeración (2 – 8º C ). No
congelar.

b) Preparación del Reactivo
Pyrotell ®.

1.- Antes de rehidratar, golpear suavemente
el vial contra la superficie de la mesa, para que todo el polvo
caiga al fondo del vial..

2.- Remueva el sello y el tapón de
goma del vial .

3.- Rehidratar con 1 ml de agua destilada
libre de pirógenos, utilizando una pipeta
despirogenizada..

4.- Agitar suavemente el vial en forma
circular, hasta lograr una dilución homogénea del
reactivo. La formación de espuma debe ser evitada,
para no afectar negativamente la sensibilidad del
Pyrotell.

El reactivo Pyrotell deberá
mantenerse refrigerado todo el tiempo. Durante su
utilización, debe ser conservado sobre hielo o gel pack.
El reactivo deberá ser transparente o ligeramente opaco.
Una coloración amarilla y/o presencia de
partículas, son indicativos de contaminación o
deterioro.

c) Preparación de la
Muestra.

1.- Si la muestra es clara, no hacer
dilución de la misma. Si es turbia, hacer
dilución transfiriendo 0.1 ml de la muestra al tubo
correspondiente y agregar 0.9 ml de agua destilada libre de
pirógenos

(Factor de Dilución 1:10). El
Factor de Dilución se utilizará en el
cálculo del resultado final.

d) Preparación de las diluciones
del Estándar de Endotoxinas.

1.- Marque tubos de vidrio, libres de
pirógenos, cap. 20 ml, con las siguientes
diluciones: 10, 1, 0.1 , 0.05, 0.025, 0.0125, 0.006, 0.003
ng/ml.

2.- A partir de la solución
estándar (100 ng/ml) , preparar una serie de diluciones,
hasta alcanzar una concentración correspondiente a
la mitad de la sensibilidad del LAL que se utilice,
según se describe a
continuación:

Para cada ensayo se deberá preparar
una nueva serie de diluciones a partir del estándar
refrigerado.

e) Preparación de las diluciones
de la Muestra.

A partir de la dilución 1:10,
preparar una serie de diluciones hasta alcanzar los niveles de
Endotoxinas esperados, valor que
dependerá de la sensibilidad del Lal que se
utilice.

A continuación se presentan un
cuadro de diluciones de la muestra, según tres niveles de
sensibilidad del Lal:

Cuadro de Diluciones de la Muestra
según la Sensibilidad del Lal (Opcional).

Marque tubos de vidrio, libres de
pirógenos, cap. 20 ml, con los factores de
dilución: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, etc., según sea
necesario, y proceda a efectuar las diluciones descritas a
continuación:

Generalmente nos interesa saber si la
muestra se encuentra por debajo de 1 ng/ml, por lo tanto el
análisis llegará hasta la dilución
correspondiente, según la sensibilidad del Lal.

En casos en que se esperen niveles mayores
a 1 ng/ml, la serie se prolongará hasta dónde sea
necesario.

6.4.1.3 Procedimiento:

1.- Preparar una serie de 10 tubos de 10×75
mm, despirogenizados, en una gradilla, preferentemente dentro de
una campana de flujo laminar.

2.- Agregar 0.1 ml de las series de
diluciones de muestra, estándar y agua libre de
pirógenos (control negativo) a los correspondientes
tubos.

3.- Seguidamente, agregar a cada uno de los
tubos 0.1 ml del reactivo Lal reconstituido.

4.- Mezclar suavemente con movimientos
circulares, evitando la formación de espuma.

5.- Incubar los tubos a 37 + 0.5º C,
por 60 min. Evitar mover y/o golpear los tubos durante su
incubación

6.4.1.4 Lectura e Interpretación de los
Resultados:

1.- Al finalizar el período de
incubación (60 + min) efectuar la lectura de
los tubos, en forma secuencial, sin retirar la gradilla del
Baño María, invirtiendo suavemente los mismos para
detectar formación de coágulo.

La prueba se considera positiva si se forma
un coágulo firme que no colapse al invertir
180º el respectivo tubo.

2.-Empezar la lectura por el control
negativo. Si la lectura resultare positiva (formación de
coágulo), se invalidará toda la prueba por
contaminación de los materiales o reactivos.

Lectura del Estándar de
Endotoxinas: Leer las diluciones del estándar de
endotoxinas para comprobar la sensibilidad del Lal
(Pyrotell).

Sensibilidad de Pyrotell 0.003
ng/ml: Si la sensibilidad del Pyrotell es de
0.003 ng/ml, se debe esperar coágulo en los dos primeros
tubos (0.006

y 0.003 ng/ml). Se puede obtener
coágulo también en el tercer tubo
(0.0015 ng/ml), pero nunca en el cuarto tubo
(0.0007).

Sensibilidad de Pyrotell 0.006
ng/ml: Se debe esperar coágulo en los dos primeros
tubos (0.012 y 0.006 ng/ml). Se puede obtener coágulo
también en el tercer tubo (0.003 ng/ml), pero nunca en el
cuarto tubo (0.0015).

Sensibilidad de Pyrotell 0.0125
ng/ml: Se debe esperar coágulo en los dos primeros
tubos (0.025 y 0.0125 ng/ml). Se puede obtener
coágulo también en el tercer tubo
(0.006 ng/ml), pero nunca en el cuarto tubo (0.003).

Sensibilidad de Pyrotell 0.0250
ng/ml: Se debe esperar coágulo en los dos primeros
tubos (0.050 y 0.025 ng/ml). Se puede obtener coágulo
también en el tercer tubo (0.0125 ng/ml), pero nunca en el
cuarto tubo (0.006).

4.- Lectura de la Muestra: Leer las
diluciones de la muestra buscando la mayor
dilución en que se observa coágulo firme con el
tubo invertido.

6.4.1.5 Cálculos:

Se toma en consideración la
máxima dilución en la que se observó
coágulo firme y se multiplica por la sensibilidad del
Pyrotell y por el factor de dilución de la muestra, si se
hubiera hecho dilución previa..

El resultado será la
concentración de endotoxinas de la muestra.

Endotoxinas = (D) x (S) x
(I)

D = Ultima dilución seriada de la
muestra con coágulo firme

S = Sensibilidad del Pyrotell

I = Dilución inicial de la muestra.
(opcional)

Ejemplo: Última dilución:
1:8

Endotoxinas = (8) x (0.0125) x (10) (si
hubiera)

Endotoxinas = 1 ng/ml.

Nota: Para convertir ng/ml a EU/ml
hay que multiplicar por 10. Así,

1.0 ng/ml = 10 EU/ml.

Requisitos
mínimos de calidad en la hemodiálisis
actual

En España, el
agua utilizada en la fabricación del líquido de
diálisis debe cumplir la norma UNE 111-301-90 de Enero de
1990 y publicada en 1991 en el Journal de Nefrología.
Estas normas se basan en la Norteamericana aprobada en 1981 por
el American National Standards Institute, Inc (ANSI
;AASI), que fija la resistencia
mínima del agua, las concentraciones máximas
admisibles de diversos electrolitos y sustancias y los
límites aceptables en cuanto a contaminación
bacteriana. Estos límites son < 200 UFC/ml para el agua
y < 2000 UFC/ml para el LD.

La European Pharmacopoeia corrientemente
establece los límites máximos de bacterias y
endotoxinas en 100 microorganismos y 0.250 EU/ml de
endotoxinas.

Se ha mostrado reacciones
pirogenéticas inducidas a niveles de endotoxinas de 5
EU/kg. Esto representa un nivel de 300 EU para un paciente de 60
kg de peso. Una carga de 300 EU se logra si se filtran 1.2 litros
de dializado con una concentración de endotoxina de 0.250
EU/ml. Hay que tener en cuenta que se requieren más de 1.2
litros de dializado durante una sesión de diálisis
con un dializador del alto flujo. Esto sugiere que los
estándares de la Farmacopea Europea no sean
suficientemente terminantes para la hemodialisis de alto
flujo.

Normas de calidad del agua y
líquido de hemodiálisis

Nota : 1 ng/ml = 10 EU/ml de
Endotoxinas

Glosario de
términos

Agua altamente purificada o ultra
pura: Se define como agua altamente purificada o ultra pura
la que se ajusta a un contenido de contaminantes
químicos.

Tiene menos contaminación
bacteriana, aproximadamente de 10 UFC/100 ml y menos de 0,25
UE/ml. Referencia: Real Farmacopea Española 2.1.
07/2002:1927; pág. 2950. European Pharmacopoeia 4.3
07/2002:1927; pág. 3157.

Agua de aporte o bruta: Se entiende
como agua de aporte al agua que se va a tratar, bien si procede
de la red municipal, se capta de un pozo o se recibe en camiones
cisterna.

Agua de rechazo o "concentrado": Es
el agua que no ha pasado a través de las membranas de
ósmosis y que lleva la práctica totalidad de las
sales y de los contaminantes.

Agua estéril
apirógena: Es el agua libre de organismos vivos y
esporas. La esterilidad viene definida como la ausencia de
bacterias viables y < 0,03 UE/ml de endotoxinas.

Agua pretratada: Es el agua sometida
a todos los procesos
previos a su llegada al equipo de ósmosis o
tratamiento.

Agua purificada: Es el agua
destinada a la preparación de medicamentos o de
líquidos de diálisis que no deben ser
necesariamente estériles y exentos de
pirógenos.

AAMI – Asociación para el
Avance de la Instrumentación
Médica:

Recomienda estándares para procedimientos
médicos en los Estados Unidos
de América. www.aami.org.

Bacterias heterótrofas:
Bacterias que desde el punto de vista metabólico dependen
para su desarrollo de
la utilización de compuestos
orgánicos. Este es un grupo muy
amplio y diverso que incluye especies simbiontes, saprofitas y
patógenas. El término heterótrofo se utiliza
comúnmente como nombre genérico para las bacterias
del agua con escasos requerimientos nutricionales.

Biofilm: Colonias de bacterias
asentadas sobre las superficies de los circuitos
hidráulicos, protegidas por un ecosistema de
precipitados minerales y una
matriz
polisacárida mucosa extracelular, que se reproducen y
generan en lugares de estancamiento. Su presencia se asocia a
fuerte contaminación bacteriana >1000

UFC/ml.

Caudal nominal: Es el caudal que
produce un equipo de ósmosis inversa en condiciones
ideales.

Cloraminas: Productos formados por
la combinación del cloro libre con amonio. El amonio puede
proceder de la descomposición vegetal, otros contaminantes
orgánicos o aportado por los responsables de la
potabilidad del agua para desinfectarla

Descalcificador o "ablandador":
Dispositivo para reducir la dureza del agua, mediante la
eliminación del calcio y magnesio por intercambio
iónico con cationes ligados a resinas.

Desinfección: Proceso de
destrucción de microorganismos, que reduce su
número, pero no los elimina. La esterilización
reduce el número hasta un nivel seguro, dado que la
eliminación total es virtualmente imposible. Puede ser
química o
térmica.

Desionizador (DI): Dispositivo para
reducir los iones libres en el agua, mediante lechos dobles o
mixtos de resinas catiónicas y
aniónicas.

Endotoxina: Sustancia
pirógena y biológicamente activa,
lipopolisacárida, liberada de la pared celular externa
bacteriana Gram-negativa. Se miden en Unidades de Endotoxina
UE/ml

Filtro de carbón activado:
Filtro empleado para eliminar del agua cloro, cloraminas y
sustancias orgánicas, por medio de la adsorción de
la estructura
micro porosa del carbón activado.

Filtro de cartucho: Esta formado por
un cilindro de material poroso que al pasar el agua a
través de él retiene las partículas de menor
tamaño que el del poro.

Filtro de cartucho bobinado: Es un
filtro de cartucho formado por un alma
rígida perforada en el que el material poroso esta formado
por un cordón que puede ser de algodón, polipropileno u otro similar y que
dependiendo del tipo de hilo, del numero de hilos por vuelta y de
la presión
del bobinado se obtiene mayor o menor capacidad de filtrado.
Pueden retener partículas entre 1 y 100
µm.

Filtro de cartucho plisado: Es un
Filtro de cartucho formado por un alma rígida perforada en
el que el material poroso es de poco espesor y mucha
superficie,

"una especie de papel" y doblado en zigzag,
sellado por ambos extremos y unidos al alma. La capacidad de
filtrado lo determina la porosidad del material filtrante. Pueden
retener partículas y bacterias de hasta 0,2
µm.

Filtro de lecho: Filtro compuesto
por un recipiente lleno de un material rígido granulado de
tamaño homogéneo, que retiene las partículas
en los espacios libres.

LAL Limulus Amebocito Lisado (Analisis
de Lisado de Amebocito de Limulus): Ensayo especifico de
detección de endotoxinas, basado en el lisado de
amebocitos del cangrejo Limulus polyphemus.

Lavado a contracorriente: Proceso a
que se somete un filtro de lecho consistente en introducir el
agua por la parte inferior a un caudal ascendente para esponjar
el lecho y permitir la eliminación de las
partículas retenidas. Para el correcto lavado la velocidad del
agua debe ser ligeramente superior a la velocidad de
fluidificación para conseguir un esponjamiento
del lecho en un 10% al menos.

Lavado a corriente: Proceso a que se
somete un filtro de lecho consistente en introducir el agua por
la parte superior y eliminar el agua utilizada en el lavado a
contracorriente, que no ha sido filtrada.

Líquido de diálisis
ultrapuro: Líquido de diálisis producido
preferentemente con agua altamente purificada, con menos de 1
UFC/ml y menos de 0,03 UE/ml de endotoxinas y que ha pasado por
un ultrafiltro inmediatamente antes del dializador.

Lipopolisacáridos (LPS):
Endotoxinas compuestas por lípidos y
azúcares (polisacáridos).

Microfiltro: Filtro que es capaz de
eliminar partículas menores a 1 µm de
diámetro. (0,1-0,3 µm según la
AAMI).

Nanofiltración: retiene
compuestos orgánicos con pesos moleculares entre
300 y 1000 D. retiene algunas sales y trabaja a menos
presión que la OI.

Ósmosis Inversa (OI): Proceso
de purificación del agua mediante el tamizado a
través de una membrana y rechazo del concentrado
iónico. Elimina iones y contaminantes orgánicos de
peso molecular > 100 D.

Permeado o "filtrado": Fluido que ha
pasado a través de una membrana de ósmosis
inversa.

Pirógeno: Sustancia que
induce fiebre. Los
pirógenos externos (endotoxinas / exotoxinas) inducen
pirógenos internos, citoquinas, como IL-1 o TNF a, que son
mediadores en la inducción de fiebre e inflamación. Sustancias capaces de activar
a las células
mononucleares de la sangre.

Prefiltro o "filtro de
sedimentación o de arena": Filtro de lecho que elimina
grandes partículas, entre 500 – 20 µm y se
coloca en el agua de entrada al tratamiento.

Permite contralavados.

Resina: Cationes, aniones o mezcla
fijada a gránulos, en los lechos de intercambio
iónico como los de los descalcificadores y
desionizadores.

Resistividad: Resistencia de un
medio al paso eléctrico. Es la inversa de la
conductividad. A menor número de electrolitos mayor
resistividad. Una resistividad de

1M O/cm es lo mismo que una conductividad
de 1 microS/cm.

Unidades de endotoxinas por ml
(UE/ml): Unidades de endotoxinas (ET) tituladas mediante
una prueba basada en la activación de un lisado de
amebocitos Limulus (LAL). Anteriormente la unidad de medida era
el ng/ml. 1 ng/ml=10 EU/ml.

Unidades formadoras de colonias
(UFC): Unidad de medida de bacterias viables. Refiere el
número de colonias bacterianas que se han desarrollado en
un medio de cultivo sólido. Se expresan en UFC por
mililitro de líquido.

Ultrafiltración, como
método de diálisis: Transporte convectivo de
solutos a través de una membrana, mediante un
gradiente hidrostático de presiones (presión
transmembrana).

Ultrafiltración, como tratamiento
del LD: es un proceso
similar a la OI.

Rechaza contaminantes entre 1000 D y 0,1
µm La ultrafiltración requiere presiones bajas para
operar. Retiene fundamentalmente sustancias orgánicas,
bacterias y pirógenos. La efectividad de las membranas en
ultrafiltración se determina como el menor peso molecular
que rechaza mas del 90 % .

Ultrafiltro: Filtro de membrana
(polisulfona, poliamida) empleado para eliminar los componentes
microbianos del agua de diálisis, en el post-tratamiento
del agua de diálisis o más comúnmente en los
líquidos de diálisis. Algunos ultrafiltros retienen
ET por adsorción. También se usa como
sinónimo de dializador.

Ultravioleta: Radiación
ultravioleta utilizada para eliminar microorganismos.

USP: United States
Pharmacopoeia.

Velocidad de fluidificación:
Es la velocidad de contralavado de un filtro de lecho a la que
este se ve sometido a una fuerza
ascendente igual a su peso. Su volumen aparente no varía,
su esponjamiento es cero.

Volumen aparente de un lecho: Es el
volumen que ocupa un lecho cuando se esponja con un lavado
contracorriente.

Volumen real de un lecho: Es el
volumen que ocupa un lecho en un recipiente.

Se entiende que el espacio existente entre
las partículas es un volumen ocupado por el propio
lecho.

Bibliografía
de interés

• 1. Pegues DA., Oettinger CW., Bland LA., Oliver
  JC., Arduino MJ., Agüero SM., McAllister SK., Gordon
  SM., Favero MS., Jarvis WR. A prospective study of
  pyrogenic reactions in hemodialysis patients using
  bicarbonate dialysis fluids filtered to remove bacteria and
  endotoxin. J Am Soc Nephrol 1992 ; 3 :
  1002-1007.

• 2. Ismail N., Becker BN., Hakim RM.
  Water treatment for hemodialysis. Am J
  Nephrol 1996 ; 16 : 60-72.

• 3. Hosokawa S., Oyamaguchi A., Yoshida O.
  Trace elements and complications in patients
  undergoing chronic hemodialysis. Nephron 1990 ; 55 :
  375-379.

• 4. Barril G, Pérez R, Torres T, Barrio
  V, Valderrabano F. Acute anemia in a hemodialysis
  program caused by the appearance of high chloramine levels in
  the water. Med Clin (Barc) 1983 ; 80 :
  483-86.

• 5. Bárány P., Divino JC.,
  Bergström J.: High C-Reactive Protein is a strong
  predictor of resistance to Erythropoietin in Hemodialysis
  patients. Am J Kid Dis 1997 ; 29:
  565-568.

• 6. Bergström J, Heimbürger O,
  Lindholm B, Qureshi AR : C-reactive protein as
  predictor for serum albumin and mortality in
  hemodialiysis. Gen Am Soc Nephrol 1995 ; 6
  :573-577.

• 7. Pérez Sheriff M., Martin Moreno S.,
  Ordas Izquierdo F. Unidades de hemodiálisis.
  Guias de Programación y Diseño.
  Ed. Ministerio de Sanidad y Consumo, Secretaria General
  tecnica. 2ª Ed. Madrid. 1989. Pp 1-85.

• 8. Real Farmacopea Española. Agua
  para dilución de disoluciones concentradas para
  hemodiálisis. Real Farmacopea Española
  1997 ; 1167: 375-377.

• 9. Real Farmacopea Española.
  Hemodiálisis, disoluciones .Real
  Farmacopea Española 1997 ; 0128: 1064-1067

• 10. Comité técnico Aenor. Norma
  UNE 111-301-90. Características del agua
  utilizada en hemodiálisis. Nefrología
  1991 ; 11:7-8.

• 11. Comité técnico Aenor. Norma
  UNE 111-325-89: Hemodializadores, hemofiltros y
  hemoconcentradores. Nefrología 1991 ; 11 :
  134-143.

• 12. AAMI. Standards for hemodialysis
  systems. ANSI/AAMI. RD 5. 1981.

• 13. R. Pérez García, P.
  Rodríguez Benítez y Juan Antonio Ayala.
  Tratamiento del agua para hemodiálisis.
  Características del líquido de
  diálisis . Capítulo 5. En Tratado de
  Hemodiálisis. Ed. F.Valderrábano. Edit.
  Médica Jims SL. Barcelona. 1999. Pp.75-90.

• 14. Bambauer R, Schauer M, Jung WK, Vienken J,
  Daum V. Contamination of dialysis water and
  dialysate , a survey of 30 centers. ASAIO 1994 ; 40:
  1012-1016.

• 15. Arvanitidou M, Spaia S, Katsinas C,
  Pangidis P et al. Microbiological quality of water and
  dialysate in all haemodialysis centres of Greece.
  Nephrol Dial Transplant 1998 ; 13: 949-54.

• 16. Lonnemann G :Assessment of the
  quality of dialysate. Nephrol Dial Transplant 1998 ;
  13 (Suppl 5) : 17-20.

• 17. G. Lonnemann: Dialysate
  bacteriological quality and the permeability of dialyzer
  membranes to pyrogens. Kidney Int 1993 ; 43, suppl.
  41: 195-200.

• 18. Sundaram S, King AJ, Pereira BJ.
  Lipopolysaccharide-binding protein and bactericidal
  /permeability-increasing factor during hemodialysis :
  clinical determinants and role of different
  membranes. J Am Soc Nephrol 1997 ; 8 :
  463-470.

• 19. Canaud BJM, Mion CM : Water
  treatment for contemporary hemodialysis (Chap. 8),
  en : Replacement of renal function by dialysis, edited by :
  Jacobs C, Kjellstrand CM, Koch KM, Winchester JF. Kluwer ed.
  Netherlands 1996, pp 231-255.

• 20. Cross J. The development of water
  treatment technology for hemodialysis. Dial &
  Transplant 1997 ; 26 : 596-605.

• 21. Villforth JC. FDA safety alert :
  Chloramine contamination of hemodialysis water
  supplies. Am J Kid Dis 1988 ; 11 : 447.

• 22. Botella J, Traver JA, Sanz-Guajardo D,
  Torres MT, Sanjuan I, Zabala P. Chloramines, an
  aggravating factor in the anemia of patients on regular
  dialysis treatment. Proc EDTA 1977 ; 14 :

• 23. Pass T., Wright R., Sharp B., Harding GB.
  Culture of dialysis fluids on nutrient-rich media for
  short periods at elevated temperature underestimate microbial
  contamination. Blood . Purif 1996 ; 14 :
  136-145.

• 24. Vincent FC, Tibi AR, Darbord JC : A
  bacterial biofilm in a hemodialysis system. Assessment of
  desinfection and crossing of endotoxin. Trans Am Soc
  Artif Organs 1989 ; 35 : 310-313.

• 25. Jensen E. Ozone : The alternative
  for clean dialysis water. Dial Transplant 1998 ; 27
  : 706- 712.

• 26. Graeber W., Halley SE., Lapkin RA., Graeber
  CA., Kaplan AA. Protein losses with reused
  dialyzers. J Am Soc Nephrol 1993 ; 4:
  349.

• 27. Estudio microbiológico de
  bacteriemias y fungemias en pacientes en hemodiálisis
  crónica. M.S. Zarate, L. Vargas, A. Lanza, S.
  Relloso, y col. Revista Argentina de Microbiología
  (2005) 37: 145-149

• 28. Calidad bacteriológica del
  dializado en un área sanitaria. J. M. Lamas,
  M. Alonso, F. Sastre, J. A. Saavedra, G.
  García-Tríoy L. Palomares. NEFROLOGÍA.
  Volumen 27. Número 2. 2007

• 29. Outbreaks of Gramnegative bacterial
  bloodstream infections traced to probable contamination of
  hemodialisis machines – Canada, 1995: United
  Stated, 1997; and Israel, 1997. CDC – MMWR, 1998:
  47;55-59

• 30. Guías de Gestión de
  Calidad del Líquido de Diálisis (LD) .
  Sociedad Española de Nefrología. Última
  modificación: 6-octubre-2003

• 31. Tratamiento del agua para
  hemodiálisis. I. Torregrosa, A. Pérez
  y M. Jiménez. NEFROLOGIA. Vol. XVIII. Núm. 1.
  1998

• 32. TML/MSH. Sterile Fluid
  Manual. Policy & Preocedure Manual. Predialysis
  fluid. Mount Sinai Hospital. April 6, 2005

• 33. Protocolo de recogida de muestras
  para cultivo del dializado y del agua tratada.
  Metodología y resultados. Beatriz Durana Tonder y
  col. Rev Soc Esp Enferm Nefrol 2004; 7 (1):
  6/8

• 34. Contribución a
  la normatización de la metodología
  analítica en el control microbiológico de agua
  y líquido de hemodiálisis. Ricardo
  Botta.

• 35. Calidad
  microbiológica del agua utilizada en la Unidad de
  Hemodiálisis del Instituto de
  Nefrología . Yamiris Teresa Gómez D y
  col. Unidad Nacional de Salud Ambiental, Ministerio de Salud
  Pública, Ciudad de La Habana, Cuba.

• 36. Milton, Donald K.
  “Bioaerosols " (CRC Press Inc., 1995) 77-86.
  2.SKC Inc., 863 Valley View Road, Eighty Four, PA 15330.
  “Procedure for Collection of Air Samples for Endotoxin
  Testing."

• 37. Normas de bioseguridad
  universales para su aplicación en los servicios de
  hemodiálisis: Conclusiones de las Primeras Jornadas de
  Bioseguridad en Diálisis. Consejo de
  Hemodiálisis, Asociación Nefrológica de
  la Ciudad de Buenos Aires, Julio de 1993. Rev. Nefrol.
  Diál. y Transpl., N° 35 – Marzo 1994, Pág.
  1-18

Autor:

Lic. Eric Caballero J.